蒙娜丽莎是意大利最早的一幅半身画像，画中人物坐著并把交叠的双手搁在座椅的扶手上，从头部至腰部完整的呈现出半身形体，一改早期画像只画头部及上半身、在胸部截断的构图，为日后的画家及摄影师树立新的肖像图基本架构。

达·芬奇使用金字塔结构来将画中的女士简单而充满地放置在画中。她的叠在一起的手构成金字塔前方的角。她的胸部、颈部和面部焕发出与她的手同样的柔软的光芒。这些有机部分的光芒的变化显示出肉体的丰满和柔润，包括上述的笑容。西格蒙德·弗洛伊德将这个笑容理解为画家对他母亲的性感的怀念。其他人将它描写为天真的、诱媚的或甚至于出神的或悲伤的。应该指出的是达·芬奇当时的肖像画多半带有这样的微笑。

神秘的蒙娜丽莎除了以其微笑著称，画中人物的眼神也相当独特。无论你从正面哪个角度赏画，都会发现蒙娜丽莎的眼睛直视著你，这使人感到蒙娜丽莎的眼睛彷佛是活的，会随着观众的视角游走，并对所有观众抱以永恒的微笑。

一些学者试着讨论为什么不同的人对这个微笑的感觉不同。这些理论有科学性的，也有的从蒙娜丽莎的实际人物和感觉出发。有人说，蒙娜丽莎的微笑只有在 斜眼看的时候才看得出来。还有人认为这个微笑如此捉摸不定因为它利用了人的视觉中的干扰。提出蒙娜丽莎是米兰公爵夫人的理论的人说，蒙娜丽莎的微笑是如此 悲伤因为这位公爵夫人本人的生活很悲伤，因为她的丈夫如此有权势、是个酒鬼和经常打她。这为公爵夫人自己曾说她是世界上“最不幸的妻子”。

虽然这幅肖像的手法简单，但人与背景之间的和谐使这幅画成为历史上最著名的、分析得最细致的一幅画。画中妇人的头发与衣服的曲线与背景中山谷和河流的弯曲相趁。整个画的和谐性体现了达·芬奇对人与自然界的联系的观念，使这幅画成为达·芬奇的世界观和他的天才的永久的记录。

在人的背后，一个遥远的背景一直延伸在远处的冰山。只有弯曲的道路和远处的桥梁显示着人的存在。模糊的分界线、潇洒的人物、光亮与黑暗的明显的对比和一个总体的冷静的感觉都是达·芬奇的风格。

蒙娜丽莎是第一幅将人画在一个想象的背景前的肖像画。有意思的是后面的风景并不对称。人左面的风景比右面的明显低。有的评论家认为这说明左面的部分是后加上去的。

蒙娜丽莎被多次修复。X光探测证明在现存的蒙娜丽莎后面还有三个过去的版本。画的薄的白杨底板的变形比原来想像的要大，因此博物馆的修理员正在考虑怎样来保持这幅画的原状。